天天都在用标记抗体，但对抗体的标记方法，你了解多少呢？

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更新时间：2022-05-20

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关注Bioss公众号的小伙伴都知道，Bioss在4月份与大家分享了直标一抗在科学研究领域应用的优势及要点，那么问题来了，直标一抗都有哪些标记物呢？其常用的标记方法你了解吗？

如此重要的问题，且听Bioss小编慢慢道来......

抗体标记是指将标记物（酶、荧光染料、生物素、胶体金等）以共价结合或物理吸附的方式与抗体进行连接，形成抗体-标记物复合物；在抗体-标记物复合物与待检物形成特异性多元复合物后，通过荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果进行检测，进而实现细胞、亚细胞、超微结构等不同水平上对抗原、抗体反应的定性及定位研究，或者应用各种免疫分析方法对体液中的半抗原、抗原进行定性和定量测定。目前抗体标记技术己被广泛用于医学病理学、免疫组织化学、分子生物学、生物制药等领域的分析研究与技术测定。下面简要介绍几种常见的抗体标记方法：

一、酶标记

以共价键结合的方式将酶联结在抗体上，得到酶标抗体复合物，之后借助酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，这些有色产物可用肉眼、显微镜、分光光度计等进行观察或测定，从而证明发生了相应的免疫反应。在生命科学的科学研究过程中，常用的抗体标记酶包含辣根过氧化物酶 (HRP)和碱性磷酸酶 (AP)。

1、辣根过氧化物酶标记

辣根过氧化物酶标记抗体一般采用过碘酸钠法。过碘酸钠法的原理是通过过碘酸钠将HRP的糖基氧化成醛基，该醛基可与抗体IgG上的氨基进行结合，形成Schiff氏碱。

2、碱性磷酸酶标记

碱性磷酸酶标记抗体时常用的是戊二醛一步法。在标记时，先将碱性磷酸酶与单抗混合，之后加入适量的戊二醛，使碱性磷酸酶和抗体蛋白的氨基分别与两个醛基结合，进而形成结合物。

二、荧光染料标记

荧光标记技术是指将能发射荧光的标记物通过共价结合或物理吸附等方式标记于目标分子的某个基团上，从而利用标记物的荧光特性来反映研究对象的信息。常见的荧光染料包含小分子荧光染料、时间分辨荧光材料、上转化发光材料、量子点荧光材料等。

1、小分子荧光染料

目前，关于小分子荧光染料的报道中，常用到的荧光基团多为芳香族的化合物，在抗体标记过程中常用到的小分子染料包含以下几类：

(1)荧光素类 (如FITC)：异硫氰酸荧光素 (FITC)是目前应用较为广泛的一种荧光素衍生物，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC标记抗体是基于FITC 的异硫氰基在碱性条件下能与IgG的自由氨基结合，进而形成IgG与荧光素的结合物。

(2)罗丹明类：是以氧杂蒽为母体的碱性呫吨染料，是生物医学中常用的一类荧光染料，一般通过与被标记物的氨基结合实现标记。

(3)花菁类荧光染料 (如Cy系列染料)：菁染料在光照下不稳定，但具有摩尔消光系数高、光谱范围广且光量子点产率高等特性，在使用时可通过染料的NHS与抗体的氨基连接，进而形成结合复合物。

(4)罗丹明或coumarin等染料的衍生物 (如Alexa Fluor)：Alexa Fluor通过利用磺酸或磺酸盐代替罗丹明或coumarin等染料中的氢原子而合成，主要通过磺酸酯活性基团与生物分子中的伯胺相结合形成琥珀酰亚胺酯稳定结构，从而实现对蛋白质、核酸等生物分子的 Alexa Fluor 荧光标记。

(5)其他染料，如吖啶、菲啶类、查尔酮和coumarin类、稠环芳烃类、噻嗪/噁嗪类、丹磺酞胺、卟啉类等。

部分常见荧光标记物的激发和发射波长

2、时间分辨荧光材料、上转化发光材料、量子点荧光材料

相对于小分子荧光染料，时间分辨荧光材料、上转化发光材料、量子点荧光材料是三种新型的荧光材料，其中，时间分辨荧光材料以镧系元素, 如铕 (Eu)、铽 (Tb)、钐 (Sm)等标记抗体, 利用时间分辨荧光仪特定的延迟一段时间测量，获得镧系元素的特异荧光信号；上转化发光材料是在受到低能量的光激发情况下，发射出高能量的光，即经波长长、频率低的光激发，材料发射出波长短、频率高的光；量子点 (quantum dots)是一类由Ⅱ－Ⅵ族或Ⅲ－Ⅴ族元素组成的能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，量子点荧光强度高且持续时间长，光化学性质非常稳定，不易发生光漂白，可经受反复多次的激发，这为研究生物细胞内分子之间的长时间作用提供了有力的工具。

在标记方法上，这三种荧光材料一般会利用表面羧基基团与抗体的氨基基团进行偶联。

三、生物素标记

生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。一般一个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

四、胶体金标记

胶体金标记是利用氯金酸在还原剂作用下聚合成直径 1~150nm的金颗粒, 形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用成为稳定的胶体状态, 称胶体金。

胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒具有高电子高密度的特性, 其表面的负电荷能与蛋白质的正电荷基团静电吸附而牢固结合。

不同免疫检测实验中经常用到的标记物类型汇总