1. 蛋白提取

1.1 组织样品

1)用灭菌的工具分离新鲜目的组织50-100mg，并用生理盐水或PBS洗净，用洁净的剪刀将组织剪碎至合适大小。

2)将剪碎的组织转移到玻璃研磨器中，加入适量含有蛋白酶抑制剂（必要时还需要加入磷酸酶抑制剂）的RIPA裂解液（每20mg组织加入150-250µl裂解液），冰上研磨2-5min，直到看不到明显的大的细胞团块，然后冰浴裂解30min，让组织细胞充分裂解。可取少量裂解后组织液滴于载玻片，盖上盖玻片在光镜下观察确认是否裂解充分。

注：RIPA裂解液有不同裂解强度，可以根据组织类型进行调整，以提高裂解效率。

3)超声处理10–15s，完成细胞裂解并剪切DNA，以降低样品粘度和提升蛋白溶解度。超声循环设置如下：超声3s，暂停10s，重复3-5次。

注：为确保组织细胞充分裂解，建议进行超声破碎。调节超声仪至适宜频率与功率（超声功率不宜过大，并设置超声间歇，以防止超声探头过度产热），将超声探头置于样本裂解液中部，但不触碰管壁或管底，进行冰浴超声。

4)超声处理后将样品继续置于冰上孵育30min。

5)将上述裂解后样品于4℃，12000rpm，离心15-20min，取上清到EP管，置于冰上备用。

1.2 细胞样品

1)贴壁细胞：从培养物中吸出培养基，用1×PBS洗涤细胞后，加入适量含有蛋白酶抑制剂（必要时还需要加入磷酸酶抑制剂）的RIPA裂解液（6孔板每孔100µl或10cm直径的平板500µl），然后立即从板上刮下细胞并将提取物转移至EP管，置于冰上。

悬浮细胞：将悬浮细胞连同培养基转移到15ml离心管，室温1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，然后加入适量含有蛋白酶抑制剂（必要时还需要加入磷酸酶抑制剂）的RIPA裂解液（6孔板每孔100µl或10cm直径的平板500µl），吸打几次后转移至EP管，置于冰上。

2)超声处理10–15s，完成细胞裂解并剪切DNA，以降低样品粘度和提升蛋白溶解度。超声循环设置如下：超声3s，暂停10s，重复3-5次。

3)超声处理后将样品继续置于冰上孵育30min。

4)将上述裂解后样品于4℃，12000rpm，离心15-20min，取上清到EP管，置于冰上备用。

2. 蛋白定量

2.1 配制工作液：根据标准品和样品数量，按体积比A：B=50：1配制适量BCA工作液，充分混匀，BCA工作液室温24h内稳定。

2.2 稀释标准品：取10µl标准品用PBS稀释至100µl，使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20µl加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20µl。

2.3 将稀释后（一般稀释5倍）的适当体积样品加入96孔板的样品孔中，加PBS补足到20µl。

2.4 各孔加入200µl的BCA工作液，37℃放置30min。

2.5 将96孔板冷却到室温，用酶标仪562nm测定OD值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

注：对于浓度过高的样品，建议用RIPA裂解液进行合理稀释并充分混匀后，再测一次浓度为宜。

3. 样品制备

3.1 上样前建议用提取样品用的RIPA裂解液将制备的组织、细胞蛋白样品的浓度统一调整为相同浓度并充分混匀，最好都在3-5µg/µl。

3.2 上样量为20-40µg（如果是纯蛋白，上样量为100ng），根据上样量计算好体积，每管样品分别与4×蛋白上样缓冲液按体积比1：3混匀。

3.3 煮沸5-10min，使样品还原变性，然后立即放于冰上备用。

3.4 剩余样品可以统一加入4×蛋白上样缓冲液后，保存在-20℃或-80℃。

4. 电泳

4.1 SDS-PAGE凝胶的制备：根据目的蛋白分子量，参考下表选择合适的分离胶浓度灌制分离胶，加入保护层（可小心加入0.5ml去离子水封压胶面）。待分离胶凝固后，倒出保护层的去离子水，再灌注浓缩胶。根据样品数量和体积，选择合适的梳子插入浓缩胶。待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内。

4.2 蛋白上样与电泳：将上述变性处理后的样品短暂低速离心后，按照实验设计的上样顺序，分别加入样品孔中。最后，加入合适的预染蛋白Marker。浓缩胶恒压80V，分离胶150V电压条件下电泳，直至指示剂溴酚兰迁移至凝胶底部。

4.3 电泳合格标准：目的蛋白条带位于分离胶的中部，并且条带充分分离。

5. 考马斯亮蓝染色（备选步骤）

在进行正式实验前，对于刚制备的蛋白样品，可取少量上样电泳后，把整张胶用考马斯亮蓝染色进行初步鉴定，以确定样品的质量。然后，再进入正式实验。

6. 蛋白转膜（湿转法）

6.1 将PVDF膜在无水甲醇中浸泡1-3min，再孵育于冰冷的电转缓冲液中5min。胶也可以在转膜液中平衡3-5min，防止转膜时条带变形。

6.2 湿转“三明治"排列顺序：海绵/滤纸/胶/膜/滤纸/海绵，全部紧密排列，特别是胶与膜之间不能留有气泡。膜的面积：5.2*8.4cm，滤纸的面积：4条边均略长于膜的4条边。

6.3 安装方向：负极与胶同侧，向正极方（膜）迁移。

6.4 200-300mA恒流转膜，转膜时间可参考下表。

7. 蛋白染色（备选步骤）

将膜置于丽春红工作液中，在室温下摇动1-5min，待蛋白带显示后用TBST或超纯水洗净膜上丽春红。

8. 封闭

为避免一抗与膜发生非特异性结合而造成背景提高，需要对膜上的潜在非特异性结合位点进行封闭处理。

8.1 封闭条件：用TBST溶解的5%的脱脂奶粉或5%的BSA（建议提前配制，使奶粉或BSA充分溶解），室温封闭1h。

8.2 注意事项：

1)脱脂奶粉不能用于磷酸化蛋白检测。因为脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，使用脱脂奶粉时，磷酸化抗体可能也会与奶粉中的磷酸化蛋白结合，从而产生高背景。

2)生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。

3)某些抗体用BSA封闭时也可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，建议参照抗体说明书进行实验。

9. 一抗孵育

9.1 用WB一抗稀释液（整张膜建议使用5-10ml），按一定比例（一般为1：1000-1：2000）稀释一抗。

9.2 倒掉封闭液，将膜置于适量一抗孵育液中，4℃水平摇床孵育过夜。

9.3 用TBST洗膜3次，每次5min。

10. 二抗孵育

10.1 用WB二抗稀释液按一定比例（HRP标记二抗1：5000-1：10000；荧光二抗1：10000-1：20000）稀释二抗。

10.2 将膜置于适量二抗孵育液中，水平摇床室温孵育1h。

10.3 用TBST洗膜3次，每次5min。

11. 显影

11.1 化学发光法（使用HRP偶联的二抗）

1)制备ECL工作液：A液和B液等体积混匀后即可使用。

2)将膜有蛋白的一面朝上平铺在一张平板上，将工作液均匀滴加在膜上，孵育1-5min。用量以充分覆盖膜为准，每10cm²膜需要大约1ml工作液。

3)用合适的照相器材直接记录蛋白膜的化学发光图或使用X射线胶片曝光，曝光5s-1min，通过调整X片的曝光时间获得最佳结果。

11.2 荧光底物法（使用荧光二抗）

将膜上多余的TBST沥干，使用合适的荧光扫描仪，根据制造商的建议扫描膜上条带。